高效制备液相在中药产物分离中的应用
[摘要]：综述高效制备液相色谱在中药有效成分的分离中的应用研究进展。用高效制备液相色谱法分离制备中药产物的单体，具有快速、高效、操作方便的优点，当其与高速逆流色谱、大孔吸附树脂及超临界CO2萃取联用时，分离效果更好。
[关键词]：高效制备液相色谱法；联用技术；中药产物；分离纯化
ApplicationofPreparativeHighPerformanceChromatographytotheSeparationofChinesemedicine
[Abstract]:Researchprogressonapplicationofhighperformancepreparativechromatography(HPPC)totheseparationofnaturalproductswasreviewed.ThecouplingofHPPCwithhighspeedcountercurrentchromatography(HSCCC)andmacroporousadsorptionresinorsupercriticalfluidextractionhasshownahigherefficiency,greaterconvenienceandahigherspeedingseparationandpreparationofmonomerfromnaturalproducts.
[Keywords]:preparativehighperformancechromatography;couplingtechnique;naturalproducts;separation
中药是我国新药研发的宝贵资源，从中药产物中寻找先导化合物并对其结构进行相应的修饰成为近年来研发新药的热点之一。为了从中药中分离出更多的有效成分，以满足化合物药效结构的高通量筛选及药理作用研究的需要，采用传统的分离技术如离心、萃取、沉淀、超滤等通常达不到所需的纯度要求。因此，还需借助于具有快速、高效的分离能力的技术。高效制备液相色谱（highperformancepreparativechromatography,HPPC）早在20世纪初便已出现[1,2]，其良好的分离度、灵敏度和高通量的筛选使其成为现阶段的天然中药产物研究中不可或缺的重要手段。
制备色谱绝不仅仅是分析色谱的简单放大，它与分析色谱有许多不同之处[3,4]。分析色谱需要全面反映样品组成的信息，不需要收集特定的馏分，洗脱液通常废弃；而制备色谱中，目标产物的产量、纯度、运行成本、生产周期等成为主要的考虑因素，洗脱液需要被反复制备以达到纯度要求。因此制备色谱与分析色谱在操作参数的优化上有很大不同。但是由于高效制备液相对样品的进样量有一定限制，因而制备色谱往往会和其他技术连用[5]，综合利用两种技术的优势，以达到更好的分离效果。本文将从HPPC及与其它技术联用在中药天然产物的分离纯化中的应用方面进行概述。
1.高效液相的概述
1.1高效制备液相的工作原理及特点
HPPC的原理是根据混合物中的成分在两种不相溶的溶剂中分配系数的差异，各组分通过在两相的相对运动在两相间发生多次分布，从而达到分离的目的。其操作示意图如图1。
与其它分离手段相比，HPPC具有以下特点[6]：1.色谱柱的填料多为高柱效的细颗粒状多孔材料，分离效率高；2.依据被分离化合物的理化性质可配备不同类型的检测器，如荧光检测器(FD)、紫外检测器(UV)、蒸发光散射检测器(ELSD)、二极管阵列检测器(DAD)等，实现稳定精确的在线检测；3.分离范围广泛，对小分子和大分子、离子型和非离子型、极性和非极性、热稳定性和热不稳定性化合物均具有较好的分离效果；4.易实现连续自动化操作。
图1制备液相系统示意图1.2高效制备液相色谱的操作参数
制备色谱并非分析色谱的简单放大，分析色谱主要针对目标产物而进行定性和定量分析，达到对化合物检测的目的；而在制备色谱中，目标产物的纯度、产量、生产周期、运行成本等成为主要的考虑因素[7,8]。因此，两种色谱在色谱柱的柱径、柱长、流动相的组成、进样量、流速、填料、操作压力、产品纯度、产品回收率、色谱分离效果等操作参数的优化上有较大的差别。
目前，分析到制备过程的操作参数主要通过线性放大的原理优化[8]。线性放大系数即为制备色谱柱的截面积与分析色谱柱截面积之比。通常假设分析和制备色谱系统的化学性质、传质过程都保持不变，分析型液相色谱的流量、进样量、收集体积等乘以线性放大系数便可得制备型液相色谱的相应参数。利用线性放大方法优化分析型色谱的操作参数，不仅可大大减少样品损失以达到快速分离效果，且可节约溶剂消耗缩短整个方法分析的时间。
1.3高效制备液相色谱的分类
按固定相的类型则可将HPPC分为正相、反相、凝胶、亲和色谱、离子交换等不同类型；按样品的进样量，可分为半制备或小规模制备型（≤mg）、制备型（0.1～g）及大规模制备型（≥g)3种类型[9]。其中正相和反相色谱柱在中药产物的分离纯化中最为常用。
2.天然产物有效成分的分离
2.1萜类化合物
萜类物质是具有异戊二烯结构单元的一大类化合物，如强心苷、三萜皂苷等，有着广泛的生物活性。该类化合物也因其植物来源广泛且药用价值显著而备受重视。目前，已有文献报道用HPPC方法分离、纯化萜类化合物[10-13]。
樊鹏程等[12]建立独一味中环烯醚萜苷类化合物，山栀苷甲酯、螃蟹甲苷II、番木鳖苷和8-O-乙酰山栀苷甲酯的快速制备色谱方法。独一味的水提物经聚酰胺色谱柱和大孔吸附树脂柱分离后，进行快速制备液相色谱分离，可同时得到4种环烯醚萜苷高纯产品，既适于用作对照品，也可满足新药研发的需要。
由于反相制备色谱柱对化学物质的吸附有选择性，有些苷类物质很难完全吸附在色谱柱上。反相制备色谱联合亲水作用色谱的二维色谱的方法有效的解决了这个问题[13]，人参叶先经过XUnionC18制备色谱柱分离，再经过XAmide亲水色谱柱的纯化，所有纯化的皂苷的纯度都达到95%以上。这种方法将能有效的纯化中药中低含量的皂苷类成分。
2.2黄酮类化合物
黄酮类化合物为一类广泛存在于自然界的重要的天然产物化学成分，具有多种药理活性。已有文献对采用HPPC分离黄酮类化合物进行了报道(见表1)。
梁晓芳等[16]用HPPC以乙腈-水为流动相从大豆中同时制备大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆素、黄豆黄素和染料木素，6种产品的纯度分别为95.54%、90.14%、%、%、96.27%、%。与以往大豆异黄酮标准品的制备相比，简便易行、产品纯度高、稳定性好，适用于大豆异黄酮标准品的制备。
制备型液相色谱纯化化学物质时，通常需要大量时间反复纯化，因此会消耗大量的溶剂。目前，二元循坏制备液相色谱[22]被应用于从水飞蓟素中分离纯化四种黄酮木脂素类成分。与传统的方法相比，该方法通过六端口转换阀选择性的切换RPLichrospherC18柱与YMCODSC18柱，显著的减少了四种黄酮木脂素类成分的分离纯化所需要的时间、大大减少了溶剂消耗量。
表1黄酮类化合物的分离
有效成分
来源
色谱条件
色谱柱
流动相
洗脱方式
流速/(ml·min-1)
纯度
苜蓿素[14]
竹茹
LunaC18ODS
（mm×10mm，10μm）
乙腈-1%甲酸水溶液（35∶65）
等度洗脱
4
98%
查尔酮类[15]
玉郎伞
SinochromODS-BP
（mm×10mm，5μm）
乙腈-0.2%醋酸水溶液（90∶10）
等度洗脱
3
96.8%
异黄酮类[16]
大豆
SHIM–packPRC-ODS
(20mm×mm，5μm)
乙腈-水
梯度洗脱
10
95.5%
山奈酚
芦丁[17]
五指莲重楼
Pu-intelligentHPLCODS
(20mm×mm，5μm)
甲醇-水
（75:25）
等度洗脱
15
98.2%
二氢黄酮类[18]
龙血竭
YEGC18-ODS
（40mm×mm，5μm）
甲醇-水
梯度洗脱
15
95.6%
芦荟大黄素[19]
大黄
EYELA柱
(mm×20mm,5μm)
甲醇-水
（35:65）
等度洗脱
10
98.2%
槲皮素
芦丁[20]
黄皮叶
YMC-ParkODS-C18
（20mm×mm,5μm）
甲醇/水-0.05%三氟乙酸
梯度洗脱
20
96.7%
儿茶素
黄芩苷[21]
红松
DaisogelODSC18
(20mm×mm，5μm)
甲醇-水
0.02%三氟乙酸
梯度洗脱
25
97.6%
黄酮木脂素
[22]
水飞蓟素
YMCODSC18
(mm×10mm,5μm)
甲醇-水
梯度洗脱
18
98%
芦丁
槲皮素[23]
白苞蒿
TorranceC18
(20mm×mm，5μm)
甲醇-0.2%醋酸水溶液
梯度洗脱
15
96.5
异黄酮类[24]
大豆
YWGC18
(mm×10.0mm,10μm)
水-0.01%TFA/乙腈
梯度洗脱
10
98.2
大麦黄苷
皂草苷[25]
大麦苗
SinoChromODS-AP
(mm×30mm,10μm)
甲醇-水
梯度洗脱
15
95.8%
97.2%
表没食子儿茶素[26]
金丝桃
SymmetryPrepC18
(mm×19mm,7μm)
甲醇-水
（45:55）
等度洗脱
5
97.0%
黄烷酮类[27]
橘子
pre-packedRegispack(mm×10mm,5μm),
甲醇
梯度洗脱
4
98.1%
黄酮苷类[28]
荷花
SymmetryPrepTMC18
(mm×7.8mm,10μm)
乙腈-水
梯度洗脱
5
98.9%
2.3有机酸类化合物
有机酸是分子结构中含有羧基的一类化合物，广泛分布于中草药的叶、根和果实中。许多有机酸具有明显的药理作用，主要包括抗氧化、抗癌、保肝、免疫调节等作用，有机酸可以经制备型高效液相色谱的制备分离得到高纯度的单体[29-33]。
Lu等[31]从石榴壳中以甲醇-0.2%三氟乙酸（32:68）为流动相成功分离得到没食子酸，采用的色谱柱为SymmetryPrepTMC18柱（mm×19.0mm,7?m），结果显示，从mg粗提物中得到没食子酸单体15mg，纯度达96%。最近，甘草酸通过两相浮式离心联合多级制备色谱联用的技术的分离纯化[32]，在最优条件下，甘草酸的纯度达99%以上。研究表明，两相浮式离心联用多级制备色谱技术是一种从中药中分离水溶性物质的可行、实用的分离方法。
2.4生物碱类化合物
生物碱是天然的含氮化合物，大多数具有较强的抗肿瘤活性。荷叶碱是荷叶中的一种阿朴啡型生物碱，是荷叶中的主要降脂活性成分。刘蜻靖等[34]用Prep-HPLC分离制备荷叶碱，反相WatersPrepNova-pakHRC18柱（mm×19mm,6μm），以乙腈-0.12%三乙胺水溶液为流动相，室温下nm检测，所得荷叶碱的质量分数大于98%，制备收得率大于49%，可以用作分析方法的对照品。
Mueller等[35]采用多种型号的制备色谱柱，以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，从生长于澳大利亚的肿柄菊中分离得到了高纯度的芴酮生物碱，它有着潜在的抗痢疾的生物活性具有广泛的研究前景。
目前分离岩黄连生物碱的方法有硅胶柱层析、凝胶柱层析、C18反相硅胶柱层析、多种柱色谱配合使用等，但传统柱色谱法始终存在不可逆吸附、样品消耗大、产物得率低等缺点。有研究采用高速逆流色谱法，可在短时间内实现生物碱的分离和制备[36]。吴杨[37]等采用高效制备液相色谱法，对岩黄连总生物碱进行分离纯化，以探其有效成分。
2.5蒽醌类成分
大黄化学成分较复杂，其主要有效成分为葱醌类衍生物，由于大黄酚和大黄素甲醚化学性质相似，它们很难达到较好的分离。田嘉铭等[38]用乙醇回流提取大黄,得到粗提取液后，用不同碱浓度的三氯甲烷溶液除去杂质，并用氢氧化钠沉淀三氯甲烷溶液中的大黄酚与大黄素甲醚，甲醇溶解后经高压制备系统分离纯化,得到大黄酚和大黄素甲醚单体成分，各成分纯度在98.7%以上。虎杖中的蒽醌类有雌激素活性，张彩宁等[39]采用制备高效液相色谱（C18,mm×75mm,10μm），对其成分进行纯化共得到20个成分，其中5个具有高雌激素活性。
2.6其它类成分
中药的种类繁多、所含化学成分种类复杂、且有一些同分异构体，采用常规方法难以进行分离、纯化。而HPPC的高效性和高灵敏性使其能有效地分离精制某些中药产物中的有效成分，目前已有文献报道用HPPC的方法分离纯化茶黄素、蟾蜍二烯羟酸内酯等[40,41]活性成分，都取得了较好的分离效果。李柰等[42]应用聚酰胺柱层析法和高效制备液相色谱法成功实现了黄蜀葵花中金丝桃苷及其异构体的分离纯化。
3.与其他技术的联用
随着用于提取分离中药中有效成分的新技术和新方法的不断涌现，研究人员发现不同技术的联用可克服各自的不足并进一步提高分离效率。
3.1与大孔吸附树脂技术的联用
大孔吸附树脂是一类不含交换基团，且具有大孔网状结构和较大表面积的高分子吸附树脂。提取物经大孔吸附树脂处理后，可去除多糖、蛋白质及杂质，再通过HPPC分离即可得到高纯度的单体化合物，使分离精制过程更加高效、快速，并大大减少溶剂的使用。
Zhang等[43]用SP-型大孔吸附树脂以四氟乙酸为酸性调节剂从蛇足石杉中富集得到石杉碱A和B，通过反相的HPPC的C18柱的基线分离进一步精制得纯度分别得到99.1%和98.6%的单体化合物。Kuang等[44]通过大孔吸附树脂分离并富集了莱菔子中的抗病原微生物的莱菔素，再以甲醇-超纯水溶液（30:70）为流动相，采用HPPC从87.5g的浓缩液（含粗品.5g）中分离制备了纯度达96.5%的莱菔素（54.3mg），通过优化HPPC与大孔树脂联用的操作参数，能显著改善样品的进样量与分离时间。
3.2与高速逆流色谱的联用
高速逆流色谱（HSCCC）为一种利用混合物中各成分在互不相溶的两相液体中的分配系数的差异，而实现有效成分的提取分离的连续高效的液?液分配色谱技术。HSCCC虽具有无不可逆吸附、可快速分离样品等优点，但也存在灵敏度较差、检测限度低等缺点，且较难寻找到合适的溶剂体系。将HSCCC与HPPC联用，可先通过HSCCC将混合物初步分离，而后使用HPPC继续纯化得到单体，既简化了溶剂体系的筛选过程，也减少了对混合物液相色谱条件的摸索过程，且能分离效率得到较大的提高。目前，已有不少有关HPPC与HSCCC联用分离天然产物中有效成分的报道（见表2）。
表2高效制备液相色谱与高速逆流色谱联用分离中药的有效成分
有效成分
来源
色谱条件
纯度
PHPLC色谱柱
流动相
HSCCC溶剂体系
洗脱方式
异芒果素
芒果素[45]
蜜树茶
GeminiC18
(mm×10mm,5μm)
乙腈-0.1%甲酸
乙酸乙酯-甲醇-水（1∶1∶2）叔丁醇甲酯-正丁醇-乙腈-水（3∶1∶1∶5）
梯度洗脱
五种三萜皂苷[46]
满天星
Shim-PackODS
(mm×20mm,5μm)
甲醇-0.02%TFA（30∶70）
正己烷-正丁-甲醇-0.02%三氟乙酸（1∶9∶1∶9）
等度洗脱
96.8%
蒽醌类[47]
巴戟天
XTerraC18
(mm×19mm,5μm)
乙腈-1%乙酸（60∶40）
正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（11:9:10:10）
等度洗脱
96.0%
松脂醇[48]
杜仲
dynamicC18
(mm×80mm,5μm)
0.01%甲酸水-0.01%甲酸乙醇
乙酸乙酯-乙醇-水
（2:1:3）
梯度洗脱
97.0%
香豆素类[49]
白花前胡
UltimateTMAQ-C18(mm×4.6mm,5μm)
甲醇-水（70:30）
石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水
（5:5:6:4）
等度洗脱
98.7%
黄酮类[50]
萹蓄
InertsilODS-SP
(mm×4.6mm,5μm)
甲醇-0.2%甲酸水
乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸
（4:1:5:0.1）
梯度洗脱
91.9%
3.3与超临界CO2萃取技术的联用
超临界CO2萃取技术是一种新型的提取分离技术，具有操作温度低、从萃取到分离可一步完成、CO2可循环使用且产品纯度和收率高等优点。将SFE与HPPC联用，可使提取纯化中药中有效成分的过程更为快速、环保、高效。
Lv等[51]采用SFE-PHPLC联用技术，从10g甘草的根中分离得到16mg光甘草定。技术条件为：C18制备色谱柱（mm×19mm,15?m），流动相为甲醇-水（70∶30）；SFE的萃取率为35.2%。SFE-PHPLC联用技术可以大规模制备药物[52]，大黄通过SFE-PHPLC联用，以甲醇-0.1%醋酸水为流动相在最佳的条件下，大黄酸的得率是回流提取法大黄酸得率的25倍且所得的大黄酸纯度达99%。
3.4与中低压柱色谱技术的联用
中低压制备色谱技术也被称为闪式制备色谱技术，其最大特点是分离速度快、效率高，可短时间内制备毫克到数十甚至达百克的样品。它不但可以应用于正相填料也可以应用于反相填料。与常压柱色谱相比，具有分辨率高、分离速度快的优势，与高效制备液相相比，具有制备量大、时间短的特点。同时可以自主填充分离柱的填料，增加分离选择性，节约生产成本。使其在天然产物分离纯化研究工作中发挥重要的作用，近几年来逐渐发展为一种备受欢迎的分离和纯化方法[53,54]。
杨新洲[55]等采用中压柱色谱和高效制备液相色谱方法联用技术，对藏药鬼箭锦鸡儿的化学成分进行分离纯化，乙醇提取物中分离得到8个单体化合物，并进一步表明所有的化合物对2个肝癌细胞株HepG2和Hep3B均有抑制作用，更好地利用和开发这一民族药用资源。
4.讨论
采用PHPLC不仅能从中药中分离得到高纯度的化合物单体，且有速度快、产率高、操作简便、便于收集的优点。已有研究者将PHPLC与大孔吸附树脂、SFE、HSCCC等技术联用，作为中草药快速提取分离系统，且成功分离得到多种传统中药（如黄柏、丹参、川芎、黄芪、甘草等）中的化合物单体。
中药种类繁多，用HPPC进行分离纯化，条件或工艺上还需要摸索；而随着普及中药提取分离新技术的应用，将PHPLC与其它技术联用以达到各项技术的优势互补的优点，也终将成为研究的重点。由于制备型高效液相色谱进行分离纯化时具有简便易行、可制备量大、产品回收率与纯度高、分离过程样品不易变性、制备周期短等特点，制备型高效液相色谱已经广泛的用于中药化学对照品的制备。同时高效制备液相中的离子交换色谱在分子生物学及药物体内代谢物的分离分析方面有着很突出的优点，在分子生物学及药物代谢研究方面的应用也日益广泛。
目前，由于制备高效液相对样品进样量仍有一定限制，目前富集足够样品进行整体动物研究还存在一定困难，因此需要与多种方法结合，尤其是与体内评价相关的中药效应物质基础研究方法，如药代动力学、代谢组学等方法，从而更准确地辨识中药的效应物质；鉴于检测器灵敏度和色谱分离的限制，制备液相不适于含量低以及制备液相不易分离即不能达到良好分离效果的成分的研究，而生物色谱技术尤其是与质谱联用技术则能很好的克服这些问题；制备液相色谱也不适于含极易挥发或破坏性成分的中药，但由于中药效应物质研究方法的多样性，可以选择其他一些合适的中药效应物质研究方法进行研究。
随着合成、植化、生化和制药等领域对高纯度组分的需求不断增加,制备型液相色谱必将得到更广泛的应用与发展。
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